1. 유전공학의 개념
유전공학 = "단백질 산물" 이용하는 기술
*유전공학에 필요한 기술*
유전자확보(cloning/isolation)
조작(manipulation)
발현 체계 구축(construction of expression systems)
형질전환체 생성(generation of genetic transformants)
2. 핵산의 성질과 분리
(1) central dogma 中
DNA duplication
- RNA primer : 복제를 위해 중합효소가 붙어야 할 곳을 알려주는 짧은 염기서열
- DNA pol III : leading strand에서 5'→3'으로 복제할 때 쓰이는 중합효소
- DNA pol I : lagging strand에서 RNA primer를 제거하고 빈부분을 메꾸는 중합효소(효소분해→Klenow enzyme)
- DNA ligase : lagging strand에서 짧게 복제된 조각(okazaki fragment)들을 이어 붙이는 효소
note! 복제를 거듭할수록 lagging strand의 길이는 마지막 RNA primer에 의해 길이가 줄어든다. 길이가 줄어들지 않게 하기 위해 telemorase가 아무런 기능이 없는 긴 DNA sequence를 telemore에 붙여준다.
(2)목표 핵산 분리 및 정제
플라스미드 DNA : 세포벽을 화학처리하여 빠져나온 물질 중에 불필요한 chromosomal DNA과 protein은 침전시켜 제거하고 크기가 작은 플라스미드만 남은 용액을 정제하여 추출한다.
chromosomal DNA : 세포벽을 화학처리하여 핵산을 노출시키고 불필요한 단백질을 제거하고 CTAB을 이용해 DNA를 용해성으로 바꾸어 DNA가 담긴 용액을 정제하여 추출한다.
RNA - mRNA : 전체 RNA 중에서 mRNA만 분리하고자 할 때 쓰인다. mRNA가 가지고 있는 3' poly tail을 이용한다. 올리고(dT)가 들어있는 용액에 RNA을 넣으면 mRNA가 올리고(dT)와 결합한다. 결합하지 않은 나머지 물질들은 용출시켜 원하는 mRNA만 추출한다.
note! RNA의 경우 농도가 A260/A280가 1.6~1.8의 값이 나오면 깨끗하게 추출했다고 볼 수 있음!!
note!DNA의 경우 농도가 A260/A280가 1.8이상의 값이 나오면 깨끗하게 추출했다고 볼 수 있음!!
3. 유전공학에서 쓰이는 효소
핵산분해효소(nuclease) - 핵산말단분해효소, 핵산내부분해효소(제한효소:restriction enzyme)
DNA ligase - DNA말단 간의 결합을 촉매하는 효소
DNA변형효소 - DNA methylase(본인이 가지고 있는 제한효소로 인해 본인의 DNA가 절단되지 않도록 제한효소의 인식배열염기를 메틸화하여 제한효소가 결합하지 못하도록 스스로를 보호하는 장치), alkaline phosphatase(염기성 탈인산화)
중합효소 - DNA-dependent DNA polymerase, RNA-dependent DNA polymerase
단백질분해효소
4.벡터 (유전자 운반체)
*cloning vector
*expression vector
플라스미드벡터
- 선발마커, 복제기점(ori), promoter, MCS(multi-cloning site), report gene(lacZ, GFP, RFP)
- pUC19, pBluescriptII
람다파지벡터 - 3분의 1정도의 구역에 외래유전자를 도입시킨다
하이브리드벡터
효모 벡터
*vector와 목표DNA를 다루는 디테일한 기술에 관하여
- 목표DNA와 벡터 자를때 앞 뒤 서로 다른 제한효소로 자르면 목표DNA가 삽입되었을때 방향성까지 control 가능
- 목표DNA와 벡터 자를때 동일한 효소 사용이 불가능하면 서로 달라붙지 않으므로 Klenow enzyme을 사용하여 각각 말단을 blunt end로 변형시켜 결합시킨다
- PCR산물을 벡터에 결합시키고자 할 때 PCR산물에는 아데닌(A)을 붙이고 벡터에는 (티민)T를 붙여 T-vector를 만들어 결합시킨다
- PCR에 쓰이는 Primer에 5~6개의 제한효소 인식사이트를 붙여주고 PCR돌리면 제한효소 인식사이트를 포함한 PCR산물을 얻을 수 있다. 그리고 나서 PCR산물과 vector를 앞 뒤 서로 다른 제한효소로 잘라주어 삽입방향을 한정시켜 클로닝 시킨다
- vector의 self-ligation을 억제하기 위해 도입전에 vector를 탈인산화시키고 나서 균에 삽입시킨다
형질전환
외부DNA를 숙주세포내에 넣어주어 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것
competent cell - 인공적인 처리(염화칼슘CaCl2법)에 의해 DNA를 도입시키는 것이 쉽게 가능한 숙주세포(거의 대장균)
*GATEWAY Binary Vector(pGWB) - LR Reaction
attR을 가지는 DNA<destination vector>와 attL을 가지는 DNA<entry clone>을 재편성하여 attB를 가지는 발현클론을 생성시키는 반응
5. 유전자 클로닝
유전자 클로닝이란? 어떤 단백질의 기능이나 성질을 알아내고자 할 때, 먼저 이 단백질을 코딩하는 유전자를, 대상이 되는 생물로부터 꺼내서 벡터에 연결하여 균과 같이 취급하기 쉬운 숙주에 도입하여 복제하고 유지될 수 있도록 하는 일련의 과정
PCR을 이용한 클로닝
①목표유전자의 전체 배열을 아는 경우
②목표유전자의 부분 배열만 아는 경우 : degenerated primer, inverse PCR
*특정 자극에 의해 발현되는 유전자 클로닝: 특정 자극을 준 처리세포에서 mRNA 분리 후 단일가닥 cDNA를 합성. 자극 주지않은 비처리세포에서 얻은 mRNA와 혼성화 시킨다. 특정자극에 의해 발현된 mRNA에서 유래한 cDNA는 결합할 상대가 없으므로 단일가닥으로 남게 된다. cDNA-RNA혼합물을 수산화인회석칼럼에 돌려주면 이중가닥 cDNA-RNA는 칼럼에 붙지만 단일가닥은 용출된다
유전자 라이브러리
게놈 라이브러리 : 플라스미드 벡터, 파지벡터, 인공염색체벡터
cDNA 라이브러리
- 평균화라이브러리 : oligo dT를 고정한 구슬을 이용하여 cDNA를 합성하여 각 유전자의 비율을 평균화시킨것
- subtraction library : 대조세포B에서 mRNA를 추출하여 구슬 위에 cDNA를 합성. 목적세포A의 mRNA에 구슬에 고정된 cDNA를 과잉으로 추가. 이 때 세포 두군데에서 발현되는 mRNA에는 구슬 위의 상보적인 cDNA와 결합하는 반면, 목적세포A에서만 특이적으로 발현되는 mRNA는 남음. 이 남은 mRNA로 만든 라이브러리가 subtraction(substracted) library.
스크리닝(screening) : 라이브러리 속에 존재하는 표적 유전자를 골라내는 작업
①DNA hybridisation을 이용하는 방법
②특정 단백질의 항체를 이용하는 방법 : DNA probe, 1차항체, 2차항체
③유전자 발현 차이를 이용하는 방법
*감산혼성화(subtractive hybridisation) : 한 종류의 세포에서 특정 유전자가 발현되고 다른 세포에서는 발현되지 않을 때 이 둘을 비교하여 발현되는 유전자를 선별. 발현세포의 cDNA에서 비발현세포의 cDNA를 빼는 방식
④특정 단백질과의 결합능력을 이용하는 방법
6. 유전자 발현
*유전자 발현 조절부위의 분석
젤지연분석(EMSA) : 자유 DNA 절편(; promoter)크기 <단백질 복합체 크기
리포터 유전자 분석 : 클로닝된 프로모터나 인핸서가 유전자 발현에 관여하는지 어느 부위가 유전자 발현에 중요한지를 알고자 할 때
전사억제기능 : antisense RNA, RNA interference(RNAi)
기능 좋은 promoter 배열 : 발현 크기가 크고 유도 할때만 발현되게 하는 promoter 사용 ex)lac promoter IPTG(lactose operon 발현 유도물질)
7. 기능 분석 수법(발현체 분석)
mRNA 분석
northern-blotting
RT-PCR
DNA micro array
단백질 분석
SDS-PAGE
western-blotting : スキムミルク、1차항체、2차항체
2차원전기영동
エドマン分解法によるタンパク質同定
LC-MS(MS/MS イオンサーチ)
표지단백질 침전법(GST Full-down) :
글루타티온수지 - GST - proteinX - ProteinX 결합단백질
*단백질 간 상호작용의 분석
酵母ツーハイブリッド法（yeast two-hybrid;Y2H）
①DBD(DNA결합 단백질 유전자)-bait(찾고자하는 단백질의 유전자), prey(찾고자하는 단백질과 상호작용하고 있을것이라고 예상되는 단백질의 유전자)-AD(전사 활성화 유전자) bait와 prey가 서로 상호작용하는 경우, 리포터 유전자 상류에서 전사가 활성화되어 리포터 발현이 촉진된다
②효모 세포 안에서 이루어지는 작용. 약한 상호작용도 검출가능한 장점을 지님
蛍光タンパク質の融合による解析
共免疫沈降法（Co-IP）
8. 단백질 공학
단백질 공학이란? 단백질 구조를 인위적으로 바꾸어 새로운 기능을 추가 또는 개선하여 유용한 단백질로 만드는 기술
단백질 추출,분리 및 정제
단백질의 특정(위치)아미노산 바꾸기
→PCR이용
새로운 단백질 제작/기존 단백질 개량
- Momoclonal Ab
- Phage display : reading frame을 변형하여 새롭거나 개량된 항체 제작
- 단백질 융합 Ab
IgG : 생명공학에 많이 쓰이는 항체이며 Y 모양. Heavy chain과 Light chain로 구성
9. 식물 유전 공학
Ti plasmid(tumour-inducing plasmid)
binary vector : T-DNA region(목표 외래 유전자가 들어가는 자리)+복제기점+선발유전자
(helper) plasmid : vir-遺伝子領域(T-DNA를 이동시킬때 필요한 코드 존재)
아그로박테리움법(Agrobacterium-mediated transformation)
- binary vector의 T-DNA영역에 목표 DNA단편 삽입
- 아그로박테리움 콤피셀에 목표형질을 가지는 위의 플라스미드DNA용액(적정한 농도로 맞춘 후,보통 250ng/ul)을 도입
- 형질전환된 DNA을 가지는 아그로박테리움을 액체배양
- 글리세롤 스톡으로 만들어 얼려두고 필요시 해동시켜 식물에 접종
- 선발유전자를 이용해 외래유전자가 염색체에 도입된 개체만 선발
*식물 형질전환에 자주 사용되는 물질
CaMV35S promoter : 강력한 전사활성을 가지는 프로모터. 식물전체에 전사활성을 가짐
NOS terminator
선발유전자(항생물질) : Rifampicin, Spectinomycin, Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin
10. CRISPR-Cas 9
DNAの二本鎖切断を原理とする遺伝子改変ツール
主に遺伝子の機能欠損（knock out）のために用いられる。ノックアウトだけではなく、DNAドナーテンプレートを同時に導入することで、標的遺伝子に新しい配列を取り組む（knock in）こともできる。
sgRNA(crRNA＋tracrRNA)と
single guide RNA : 標的とするDNA配列を特異的に認識して結合し、Cas9を導く
crRNA : 17~20, 표적 DNA배열 상보서열을 가져 표적 DNA를 인식
tracrRNA : 80~, Cas9을 crRNA에 결합시키는데 도움
Cas9(ヌクレアーぜ)から構成される
2가지 도메인이 존재
-HNH뉴클레아제 도메인 : crRNA의 상보적인 DNA 절단 = 표적 DNA 절단
-RuvC뉴클레아제 도메인 : 비상보적인 DNA 서열 절단
↓
2가지 도메인의 협조로 "Double Strand Break"이 발생(PAM배열 3~4 상류에서)
note! Cas9이 DNA를 절단하기 위해선 표적영역 하류에 PAM배열이 있어야만 한다
DSB이 발생하면 DNA는 스스로 회복하려는 기작을 가진다. DNA 수선작업에는 2가지의 기작이 존재
①NHEJ(Non-Homologous End Joining) : 절단된 DNA말단이 재결합하려고 한다. 이때 일정한 확률로 "indel"에 의한 error가 발생! 3배수 이외의 indel은 기능결손변이체를 일으키므로 이점을 이용해 표적 유전자를 knock out 시킨다.
②HR(Homologous Recombination) : 삽입하고 싶은 ドナーテンプレート를 절단배열 중간에 삽입가능! HR에 의해 DSB를 회복하려고 하면 정해진 빈도로 ドナーテンプレート를 참조해 회복을 이룬다. 이때 knock in 이 이루어지는 것이다.